بهينه سازی توليد بيوپليمر پولوالن توسط از ضايعات انار چکيده مقدمه* آئروبازیدیوم پولولوالنس

ص) )39-32 مهندسی بيوسيستم ايران دوره 48, شماره 3 پاييز 396 بهينه سازی توليد بيوپليمر پولوالن توسط Aureobasidium pullulans 3 *2 حميرا ميرزايی فرامرز خدائيان چگينی محمد جوان نيکخواه. دانشجوی کارشناسی ارشد علوم و مهندسی صنایع از ضايعات انار غذایی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران کرج 2. دانشیار گروه علوم و مهندسی صنایع غذایی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران کرج 3. استاد گروه گیاه پزشکی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران کرج )تاریخ دریافت : 395/2/2 تاریخ بازنگری : -396/3/29 تاریخ تصویب : )396/4/3 چکيده در این مطالعه بهینه سازی شرایط تخمیر جهت تولید پولوالن از ضایعات انار توسط Aureobasidium pullulans )با شماره دستیابی )KY6023 مورد بررسی قرار گرفت. روش بهینهیابی سطح پاسخ به منظور بررسی اثرات سه عامل ph اولیه درصد تلقیح و نسبت رطوبت اولیه به سوبسترا بر میزان تولید پولوالن در محیط سوبسترای جامد (SSF) مورد استفاده قرار گرفت. نتایج این آزمایشات نشان داد که حداکثر تولید پولوالن در شرایط بهینه ( ph اولیه: /5 درصد تلقیح: 5% حجمی/حجمی و نسبت رطوبت اولیه به سوبسترا: 2/5( g/kg 50/5 ± 0/35 است. بررسی ویژگیهای فیزیکوشیمیایی پولوالن به دست آمده در شرایط بهینه نیز مورد مطالعه قرار گرفت. فعالیت امولسیفایری پولوالن استخراجی 63 درصد و پایداری امولسیون محلول پولوالن به ترتیب در دمای 4 C پس و C از 30 روز نگهداری 60/5 و 58/5 درصد گزارش شد. نتایج حاصل از اندازه گیری ویسکوزیته در غلظت های مختلف نشان داد که محلول پولوالن در غلظتهای پایین )0/-0/5 درصد حجمی/ وزنی( دارای رفتار جریان نزدیک به نیوتنی بوده و با افزایش غلظت محلول از نیوتنی به رقیق شونده با برش تغییر رفتار میدهد. بررسی طیف سنجی FT-IR پولوالن بدست آمده از ضایعات انار حضور پیوندهای )6 ( α را در واحدهای مالتوتریوز تایید میکند. واژه های کليدی: پولوالن ضایعات انار روش سطح پاسخ درصد تلقیح FT-IR مقدمه* پولوالن یک هموپلیساکارید خطی خارج سلولی خنثی و محلول در آب است. این بیوپلیمر با ترکیب شیمیایی (C 6 H 0 O 5 ).H 2 O تشکیل شده است. از واحدهای مالتوتریوز با پیوند )6 ( α مالتوتریوز خود نیز از سه واحد گلوکز با پیوند )4 ( α می باشد. وجود پیوندهای متناوب )4 ( α و )6 ( α موجب افزایش حاللیت آن در آب سرد و گرم شده است.)Madi et al., 99; Leathers, 03( توسط شبه مخمر آئروبازیدیوم پولوالنس ( پولوالن عمدتا Aureobasidium )Pullulans تولید می شود. این شبه مخمر به طور گسترده در مکان های مرطوب به ویژه ر یو درختان خاک ر یو میشود سطح برگ گیاهان مختلف تنه صخره ها آب و بافت های حیوانی یافت.)Sutherland, 998; Chen et al., 2( اولین مطالعات مربوط به تولید اگزوپلیساکارید از سویههای آئروبازیدیوم پولولوالنس توسط تعیین خصوصیات آن توسط )938( Bauer )958( Bernier Bender et al. (959) و جداسازی و انجام شد. سپس به بررسی ساختار این بیوپلیمر پرداختند و آن را پولوالن نامگذاری کردند. جرم مولکولی پولوالن بسته به نوع سویه میکروبی شرایط محیط کشت و نوع سوبسترا مورد استفاده از چندین تا 00.)Rekha & 0 کیلو دالتون متفاوت است ( Sharma, پولوالن و مشتقات آن به طور گسترده درصنایع غذایی داروسازی فیبرسازی و الکترونیک به کار میروند. از جمله کاربردهای آن در صنایع غذایی میتوان به عنوان پوشش و تولید فیلم های خوراکی جایگزین نشاسته در فرموالسیون مواد غذایی کم کالری عامل قوام دهنده کاربرد در امولسیون ها و عامل انکپسوالسیون اشاره کرد 0( al.,.)kaneo et همچنین به عنوان یک افزودنی غذایی در بسیاری از کشورها مورد پذیرش قرار گرفته است و دارای نشان GRAS در امریکا نیز می باشد.)Choudhury et al., 2; FDA, 02( با وجود کاربردهای متعدد پولوالن در صنایع مختلف محدودیت عمده استفاده از آن قیمت باالی آن بوده است که تا حدود سه برابر قیمت سایر پلی ساکارید هایی همچون دکستران و زانتان می باشد (3 Yangilar,.(Oguzhan & استفاده از. Generally Recognized as Safe * نویسنده مسئول: khodaiyan@ut.ac.ir

3 مهندسی بيوسيستم ايران دوره 48 شماره 3 پاييز 396 ضایعات مختلف هم به لحاظ اقتصادی و هم حفظ محیط زیست مناسب است. مطالعات زیادی بر روی کاهش هزینه تولید با استفاده از منابع متنوع کربنی همچون تفاله روغن زیتون 999) (Roukas, مالس Wu et al., ( 998) al., (Youssef et آب پنیر 04) al., (Göksungur et سیب زمینی شیرین نارگیل 09( 09) al., (Thirumavalavan et دانه پالم آسیایی 3) al., (Sugumaran et شربت ذرت Sharma et ( )al., 3 و ضایعات نشاسته سیب زمینی ( al., Göksungur et ); Wu et al., 6 انار با نام علمی انجام گرفته است. Punica granatum به طور گسترده در بسیاری از کشورهای گرمسیری و نیمه گرمسیری کشت میشود ( al.,.(fischer et ایران مرکز تنوع ارقام و یکی از بزرگترین کشورهای تولید کننده انار در جهان است به طوریکه با تولید بیش از یک میلیون صادرات جهانی انار را بر عهده دارد تن در سال حدود یک چهارم.(Salehi et al., 6) با توجه به کاربرد انار در تولید صنعتی انواع فراوردههای جانبی شامل کنسانتره مربا آب و رب انار مقدار قابل توجهی پوست و هسته انار به صورت ضایعات باقی میماند. برای مثال در فرآیند تولید آب انار به ازای تن انار میشود که %8 آن پوست و 669 کیلوگرم ضایعات حاصل هسته انار میباشد %22 آن ) al.,.(moorthy et ضایعات انار با داشتن ± 0/22 40/00 درصد رطوبت ± 0/3 3/38 درصد قند ± 0/0 8/2 درصد پروتئین 9/40 ± 0/0 درصد چربی و /39 ± 0/3 درصد نیتروژن یکی از ضایعات با ارزش صنعت غذا به حساب میآید (2 al.,.(ullah et بنابراین به منظور کاهش هزینه های تولید و همچنین کاهش آلودگی های زیست محیطی میتوان با استفاده از ضایعات مختلف از جمله پوست انار محصوالتی با ارزش افزوده باال تولید نمود. هدف از این مطالعه نیز بهینه سازی تولید پولوالن توسط شبه مخمر آئروبازیدیوم پولولوالنس از ضایعات پوست انار با استفاده از روش سطح پاسخ )RSM( و تعیین خصوصیات فیزیکوشیمیایی پولوالن تولیدی می باشد. مواد و روش ها مواد اوليه پوست انار واریته ملس ساوه از شهرستان ساوه استان مرکزی تهیه گردید. محیط هیدروژن فسفات منیزیوم سولفات هیدروکلریک اسید سدیم هیدروکسید و سدیم کلرید از شرکت مرک آلمان پولوالن تجاری از شرکت هایاشیبارا ژاپن اتانول %96 از شرکت رازی و روغن آفتابگردان از شرکت اویال ایران فراهم شد. ميکروارگانيسم سویه بومی Aureobasidium Pullulans KY6023 از برگ گیاه فیکوس با شماره دستیابی (Ficus elastic) جداسازی گردید. تهیه کشت خالص به روش نوک هیف روی محیط کشت PDA صورت گرفت و پس از دو هفته نگهداری در انکوباتور با دمای C به یخچال با دمای 4 C منتقل شد. آماده سازی مايه تلقيح برای تهیه مایه تلقیح یک لوپ کامل از شبه مخمر A. Pullulans از محیط کشت PDA به ارلن مایرهای 00 میلی لیتری محتوی مایه تلقیح استریل )ساکارز 2 g/l پتاسیم دی هیدروژن فسفات 0/2 سدیم کلرید g/l g/l 60 عصاره مخمر 5 منیزیوم سولفات g/l ) با ph g/l سپس ارلن مایرها در دمای برابر با منتقل گردید. به مدت سه روز داخل انکوباتور شیکردار )S0 )Stuart, orbital incubator با دور 80rpm قرار داده شدند.)Mehta et al., 4( تخمير ضايعات پوست انار )سوبسترای جامد( 3 برای تهیه محیط کشت جامد )SSF( ضایعات انار خشک و پودر گردید. سپس 0 گرم پودر پوست انار به عنوان محیط کشت جامد در داخل ارلن مایرهای 0 میلی لیتری وارد کرده و پس از تنظیم میزان رطوبت و ph نمونه ها در دمای 2 C به مدت دقیقه استریل شدند. پس از رسیدن دمای محیط کشت به دمای محیط مطابق طرح آزمایشات درصدهای مشخصی از مایه تلقیح به ارلن مایرهای محتوی محیط کشت جامد منتقل شد. سپس نمونه ها در انکوباتور ( )Iran در دمای Shimaz Co. به مدت.)Sugumaran et al., 4( استخراج پولوالن روز نگهداری شدند به منظور استخراج پولوالن از محیط کشت جامد حدود 5 برابر حجم محیط کشت آب با دمای 4 اضافه گردید. در مرحله بعد نمونه ها با دور g 000 و دمای 4 C به مدت 4 2 ساکارز عصاره مخمر پتاسیم دی دقیقه سانتریفیوژ شدند. در این مرحله توده سلولی به طور PDA 3. Solid state fermentation 4. Biomass. Response surface methodology 2. Potato Dextrose Agar

32 ميرزايی و همکاران: بهينه سازی توليد بيوپليمر پولوالن توسط Aureobasidium pullulans از... کامل از روشناور جدا شد. سپس دو برابر حجم روشناور اتانول - با دمای اضافه و به مدت 24 ساعت در دمای 4 نگهداری گردید. در مرحله آخر جهت استخراج پولوالن نمونهها با دور g 000 و دمای 4 به مدت 0 دقیقه سانتریفیوژ شدند. در نهایت اگزوپلی ساکارید بدست آمده تا رسیدن به وزن ثابت در آون Iran( )Shimaz Co. با دمای 50 قرار داده شد.)Sugumaran & Ponnusami, ( اندازه گيری ويژگیهای فيزيکوشيميايی طيف سنجی مادون قرمز )FT-IR( این روش عمدتا برای شناسایی ترکیبات آلی جهت تعیین نوع و گروه عاملی پیوندهای موجود در کار میرود. طیف سنجی مادون قرمز سازی با قرص پتاسیم برماید در محدوده دقت با مولکولهای آن به پولوالن cm - به روش آماده 400-4000 و با 4 cm - انجام شد. در این روش از پولوالن تولیدی mg 0 mg اسپکترومتر KBr پودر FT-IR بررسی قرار گرفت. ويسکوزيته ظاهری به خوبی مخلوط شده سپس توسط USA( )Perkin Elmer Co., MA, مورد محلول پولوالن در غلظت های مختلف 0/5 0/ و 2 درصد حجمی/ وزنی تهیه گردید. سپس ویسکوزیته ظاهری آنها با دستگاه ویسکومتر چرخشی قابل برنامه ریزی ( Pro, LVDV-II )Brookfield Engineering Inc., USA با استفاده از اسپیندل ULA در دمای C و در محدوده سرعت برشی 0 تا 40 بر ثانیه اندازه گیری شد. سپس رفتار رئولوژیکی نمونهها مطابق معادله مورد بررسی قرار گرفت و مقادیر ضریب قوام )K( بر حسب میلی پاسکال ثانیه و شاخص رفتار جریان )n( به وسیله نمودارهای تنش برشی در مقابل سرعت برشی و با استفاده از قانون توان به وسیله نرم افزار آماری مینی تب ( Version ).2., Minitab, State College, PA, USA بدست آمد. )رابطه ( σ = K (du/dy) ^n در فرمول فوق σ نشان دهنده تنش برشی ( du dy ) برشی K ضریب قوام و n شاخص رفتار جریان میباشد. خاصيت امولسيفايری سرعت جهت تعیین فعالیت امولسیفایری و پایداری امولسیفایر 5 میلی لیتر روغن آفتابگردان به 5 میلی لیتر محلول صمغ پولوالن ) درصد حجمی/ وزنی( محتوی 0/02 درصد سدیم آزید به عنوان باکتری کش اضافه شد. سپس به مدت سه دقیقه در هموژنایزر با دور 0000 g هموژنیزه شد. در مرحله بعد نمونهها در فالکونهای مدرج به مدت پنج دقیقه با دور سانتریفیوژ 4000 g شدند و بالفاصله حجم الیه امولسیون شده اندازهگیری شد و محاسبه فعالیت امولسیفایری طبق معادله 2 انجام شد )رابطه 2(.(Hosseini et al., 6) 00 حجم الیه امولسیون شده حجم کل محلول = فعالیت امولسیفایری (درصد) برای اندازه گیری پایداری امولسیفایری نمونه ها پس از یک و 30 روز نگهداری در دمای 4 C و C به مدت 5 دقیقه با دور 4000 g سانتریفیوژ شدند. سپس پایداری امولسیفایری از معادله 3 محاسبه گردید. )رابطه 3 ( آناليز آماری 00 حجم امولسیون نگهداری شده حجم امولسیون اولیه = پایداری امولسیفایر (درصد) به منظور بهینه سازی عوامل موثر بر تولید پولوالن از روش سطح پاسخ )RSM( و طرح مرکب مرکزی )CCD( 2 استفاده شد. بر اساس انجام آزمایشات مقدماتی سطوح و دامنه تغییرات هریک از متغیرهای مستقل ph( درصد تلقیح )v/v( و نسبت رطوبت به سوبسترا( در جدول آمده است. آنالیز دادهها در سطح احتمال 5 درصد و با استفاده از نرم افزار آماری مینی Version.2., Minitab, State تب ( )College, PA, USA انجام شد. نتایج آزمایشگاهی حاصل از طرح مرکب مرکزی با استفاده از معادله چند جمله ای درجه دوم )معادله 4( بررسی شد. در این معادله پاسخ پیش بینی Y شده C ii C i C 0 و C ij ضرایب ثابت X i و X j متغیرهای مستقل هستند. برای بررسی دقت مدل نیز از ضریب تبیین ( 2 R( و آزمون عدم برازش استفاده گردید. تمام شکلها با استفاده از اکسل 3( )Excel و Design-Expert.0, ( Design Expert )Delaware, USA رسم شدند. )رابطه 4 ( نتايج و بحث بهينه سازی توليد پولوالن 3 3 2 3 Y = C 0 + i= C i X i + i= C ii X i + i= j<i C ij X i X j برای انجام آزمایشات بهینه سازی از روش سطح پاسخ استفاده شد. در این روش از طرح مرکب مرکزی )CCD( با شش تکرار در نقطه مرکزی و تعداد فاکتور ph درصد تلقیح )v/v( تیمار برای بهینه سازی اثر سه و نسبت رطوبت به سوبسترا استفاده شد. ماتریس طرح نتایج بدست آمده و پیش بینی شده در جدول 2 نشان داده شده است. 2.Central composite design. Supernatant

322 مهندسی بيوسيستم ايران دوره 48 شماره 3 پاييز 396 -α 4/5 5 0/5-0 متغیر ها جدول - سطوح و مقادير متغير های مستقل 0 + 2 +α /5 2/5 نماد x x 2 x 3 ph درصد تلقیح )v/v( نسبت رطوبت به سوبسترا تیمار 2 3 4 5 6 8 9 0 2 3 4 6 8 9 جدول 2. سطوح متغيرهای مستقل و نتايج مربوط به ميزان توليد پولوالن مقدار به دست آمده مقدار پیش بینی شده )g/kg( 3/6 8/00 /88 6/68 6/5 32/ 0/82 /2 /43 /43 /43 /43 5/24 9/54 2/ 5/46 /9 28/99 /4 /4 )g/kg( 9/0 5/8 6/4 /2 34/5 0/0 9/0 9/0 6/4 /6 8/0 5/6 9/0 0/0 8/0 /6 29/0 8/4 /6 x 3 /0 /0 /0 /0 0/5 2/5 x 2 )%v/v( 0 0 0 0 5 x 4/5 /5 مشاهده شده میباشد و تنها %3/06 از کل تغییرات توسط مدل پیشنهادی قابل توصیف نبوده است. آنالیز داده ها و حل معادله 2 به منظور دستیابی شرایط مناسب برای تولید پولوالن نشان داد که بیشترین میزان تولید پولوالن در شرایط بهینه :ph( /5 درصد تلقیح: v/v نتایج آنالیز واریانس )ANOVA( در جدول 3 نشان میدهد که راندمان تولید پولوالن در سطح اطمینان %95 معنی دار ( < P 0.05( و آزمون عدم برازش مربوط به آن غیر معنی دار ( > P :Y( 0.05( بوده است. بنابراین معادله 5 آمده در شرایط آزمایشگاهی مقدار پولوالن بدست )v/v( درصد تلقیح :X 2 ph :X X: 3 نسبت رطوبت به سوبسترا( که نوعی رابطه ریاضی جهت دستیابی به شرایط بهینه از طریق ارتباط بین متغیرها می باشد به خوبی با داده ها برازش میشود. ضریب تبیین R 2 این مدل %96/94 و ضریب تبیین تعدیل شده آن ( 2 )Adj-R %93/53 است که نشان دهنده قابلیت مدل در توضیح %96/94 تغییرات %5 و نسبت رطوبت به سوبسترا: 2/5( 52/50 g/kg است. )رابطه 5 ( Y = 33.4 + 29.0 X + 6.0 X2 0.3 X3 2.38 X X 0.0865 X2 X2 2.35 X3 X3 0.33 X X2 +.40 X X3.0 X2 X3

ص) )39-32 مهندسی بيوسيستم ايران دوره 48, شماره 3 پاييز 396 جدول 3. نتايج آناليز واريانس )ANOVA( مدل سطح پاسخ درجه دوم برای توليد بهينه پولوالن ارزش F ارزش P منبع درجه آزادی مجموع مربعات میانگین مربعات 0/000 28/49 26/032 260/32 رگرسیون 0 0/63 0/0 0/426 0/43 بلوک ها 0/000 5/ 332/29 996/89 خطی 3 0/004 9/ 42/942 28/83 درجه دوم 3 0/003 9/4 02/43 29/3 اثرات متقابل 3 4/424 39/82 خطای باقی مانده 9 0/24 3/5 6/485 43/32 عدم برازش 5 /39 خطای خالص 4 300/3 کل 9 در نهایت جهت تایید پیش بینی مدل سه واحد آزمایشی تحت شرایط بهینه :ph( /5 درصد تلقیح: v/v به سوبسترا: 2/5( تکرار شد. راندمان تولید پولوالن %5 و نسبت رطوبت 0/35 g/kg 50/50 ± بدست آمد که نشان دهنده قابلیت باالی مدل در پیش بینی میزان تولید تحت شرایط مختلف است. معادله 2 نشان می دهد که متغیر ph در حالت خطی )29/0( بیشترین اثر را در مقایسه با سایر متغیر ها بر راندمان تولید پولوالن دارد. شکل - الف نشان می دهد که با افزایش ph تا حد /5 میزان تولید پولوالن نیز افزایش مییابد. الزم به ذکر است که ph بهینه برای تولید پولوالن توسط سویههای ph با تاثیر روی مورفولوژی و مختلف متفاوت است. عامل نقش بسزایی در میزان تولید فعالیتهای متابولیکی سلول آنزیمهای متابولیکی و در نتیجه آن تولید پولوالن دارد.)Prajapati et al., 3( یکی از مهمترین فاکتورهای موثر در تخمیر محیط جامد میزان رطوبت اولیه است که به نوع سوبسترای جامد مورد استفاده بستگی دارد. مطابق شکل -ب در یک ثابت با ph افزایش رطوبت اولیه تا نسبت 2/5 برابر میزان تولید پولوالن افزایش مییابد. رشد و فعالیت متابولیکی میکروارگانیسم نیز به میزان زیادی تحت تاثیر میزان رطوبت و اکسیژن موجود در محیط میباشد. به طوریکه افزایش رطوبت بیش از حد به دلیل پرکردن منافذ سوبسترا در حالت جامد منجر به کاهش سرعت انتقال اکسیژن میگردد. همچنین رطوبت کم سوبسترا سرعت انتقال مواد مغذی به میکروارگانیسم را با مشکل مواجه میکند( 4 al.,.(sugumaran et یکی دیگر از عوامل موثر بر تولید پولوالن درصد تلقیح است که میزان بار میکروبی اولیه و طول مدت فاز تاخیر به آن بستگی دارد. در واقع درصد تلقیح با تاثیر روی مورفولوژی و الگوی رشد میکروارگانیسم بر میزان تولید پولوالن موثر است. نتایج نشان داد با افزایش میزان تلقیح از %5 تا %0 حجمی/حجمی میزان تولید پولوالن افزایش مییابد )شکل - ج(. در حالی که در درصدهای تلقیح باال به دلیل محدودیت دسترسی میکروارگانیسم به مواد مغذی میزان تولید کاهش مییابد (3 al.,.(sharma et بنابراین انتخاب مقدار بهینه درصد تلقیح جهت ایجاد تعادل در میزان تولید بیومس و حداکثر تولید پولوالن ضروری است. طيف سنجی مادون قرمز )FT-IR( طیف سنجی مادون قرمز بر اساس جذب تابش و بررسی جهشهای ارتعاشی مولکولها و یونهای چند اتمی صورت این روش میگیرد. عمدتا برای شناسایی ترکیبات آلی جهت تعیین نوع گروه عاملی و پیوندهای موجود در مولکولهای آن به کار میرود. زیرا طیفهای این ترکیبات معموال پیچیده هستند و تعداد زیادی پیکهای ماکسیمم و مینیمم دارند که میتوانند برای اهداف مقایسهای به کار گرفته شوند.)Islam et al., 4( عدد موجی بین 650 تا 0 بر سانتی متر اغلب اثر انگشت مولکولها چراکه میشود نامیده امکان تشخیص گروههای شیمیایی اصلی در پلیساکاریدها را میسر میسازد. مطابق شکل 2 ناحیه جذبی قوی 3300-3500 بر سانتیمتر مربوط به گروه های هیدروکسیل واحدهای قندی بوده که به طور گسترده در ساختار پلیساکاریدها مشاهده میشود. پیک موجود در ناحیه 2800-3000 بر سانتی متر نشان دهنده پیوند های متقارن و نامتقارن C-H آلکانها در نمونه مورد نظر میباشد ) al.,.(choudhury et عدد موجی 6/8 متر مربوط به پیوند متر نشان دهنده پیوند C-O-H O-C-O بر سانتی و عدد موجی 465/3 بر سانتی در ساختار واحدهای تشکیل دهنده پلی ساکارید ها است. همچنین طیف جذبی 66/68 بر سانتی متر حضور پیوندهای تایید می C-O-C کند. طیف جذبی مربوط به پیوند در اتصاالت گلیکوزیدی را در پلی C-O

324 مهندسی بيوسيستم ايران دوره 48 شماره 3 پاييز 396 ساکاریدهای مختلف بسته به تکرار واحدهای تشکیل دهنده و محل قرارگیری گروه های عاملی O-H به صورت محوری یا استوایی متفاوت است به طوریکه در ساختار پولوالن طول موج مربوط به این پیوند /66 گزارش شده است (Shingel, (02. پیک های مربوط به محدوده طول موج 650-00 بر سانتی متر به صورت اختصاصی نشاندهنده ساختار بیوپلیمر پولوالن است )جدول 4(. ناحیه جذبی در 85/98 بر سانتی متر مربوط به D-α گلوکوپیرانوزید پیک مربوط به ناحیه 4/8 بر سانتیمتر نشان دهنده پیوندهای و ناحیه جذبی پیوندهای است D-α 993/98 D-α ) 4 (گلوکوپیرانوزید بر سانتیمتر نیز مربوط به حضور ) 6 (گلوکوپیرانوزید در ساختار این بیوپلیمر.)Wang et al., 4( شکل. نمودار سه بعدی مربوط به تاثيرات ph درصد تلقيح )v/v( و نسبت رطوبت به سوبسترا بر ميزان توليد پولوالن در محيط ضايعات انار جدول 4. طيف های جذبی پولوالن صنعتی و پولوالن توليد شده توسط عدد موجی پولوالن تولید شده در ضایعات انار Aureobasidium Pullulans )cm - ( عدد موجی پولوالن تجاری )cm - ( 3399/4 3422/33 گروه های عاملی O-H C-H O-C-O C-O-H C-O-C C-O D-α گلوکوپیرانوزید ) 6( D-α گلوکوپیرانوزید D-α گلوکوپیرانوزید ) 4( 2924/ 65/9 48/6 6/0 024/0 022/ 852/8 56/0 29/98 6/8 465/3 66/68 /66 993/98 85/98 4/8 شکل 2. طيف مادون قرمز IR( )FT- پولوالن توليد شده در محيط ضايعات انار

3 ميرزايی و همکاران: بهينه سازی توليد بيوپليمر پولوالن توسط Aureobasidium pullulans از... ويسکوزيته ظاهری به منظور بررسی رفتار جریان چهار محلول پولوالن با غلظت های 0/5 0/ و 2 درصد حجمی/ وزنی تهیه گردید. همان طور که در شکل 3 مشاهده می شود با افزایش غلظت محلولها ویسکوزیته ظاهری نیز افزایش یافته است. اما رفتار جریان محلولهای پولوالن در غلظت های مختلف متفاوت بوده است. با توجه به جدول 5 ضریب شاخص قوام )K( بین 0/054 تا است که با افزایش غلظت محلول پولوالن افزایش مییابد در حالیکه مقدار عددی شاخص رفتار جریان )n( بین 0/35 تا 0/96 است که با افزایش غلظت محلول پولوالن کاهش مییابد. بنابراین محلول پولوالن در غلظت های پایین 0/ و 0/5 درصد حجمی/ وزنی دارای رفتار نسبتا نیوتنی بوده به طوریکه افزایش نرخ برش تاثیر معنی داری )0.05>p( روی ویسکوزیته نداشته است در حالیکه با افزایش غلظت محلول پولوالن به درصد حجمی/ وزنی رفتار جریان تغییر کرده و با افزایش نرخ برش ویسکوزیته کاهش یافته است که این نشان دهنده رفتار جریان از نوع رقیق شونده با برش یا همان سودوپالستیک میباشد. با توجه به نتایج بدست آمده میتوان بیان داشت که محلولهای پولوالن در غلظت های پایین دارای رفتار نسبتا نیوتنی بوده اما با افزایش غلظت از نیوتنی به رقیق شونده با برش تغییر رفتار میدهند. این رفتار سودوپالستیکی در محلولهای غلیظتر میتواند مربوط به شکسته شدن اتصاالت فیزیکی ضعیف بین بیوپلیمرها در اثر افزایش نرخ برش بوده که سبب کاهش ویسکوزیته تا رسیدن به یک میزان ثابت می شود. در حالی که در غلظت های پایین تر به دلیل کمتر بودن این اتصاالت فیزیکی افزایش نرخ برش تاثیر معنی داری بر ویسکوزیته ندارد.)McClements, ( همچنین الزم به ذکر است که نتایج مشاهده شده در این تحقیق با گزارشات بسیاری از محققین مطابقت دارد (Piermaria et al., 08; (.Lazaridou et al., 02; Tsaliki et al., 04 جدول 5. مقادير ثابتهای رئولوژی قانون توان برای غلظتهای مختلف محلول پولوالن غلظت محلول پولوالن w/v( %( 0/ 0/5 /0 خاصيت امولسيفايری در این مطالعه خصوصیات امولسیفایری پولوالن استخراج شده در شرایط بهینه در غلظت درصد حجمی/ وزنی مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که فعالیت امولسیفایری پولوالن در دمای برابر با 63 بالفاصله پس از تشکیل امولسیون درصد بوده است که این میزان بیشتر از نتایج گزارش شده در شرایط مشابه توسط al. )4( Yadav et می باشد )56 درصد(. پایداری امولسیونها نیز پس از و 30 روز نگهداری در دمای 4 و درجه سلسیوس مورد بررسی قرار گرفت. نتایج بررسی این پارامتر نشان داد که ثبات امولسیون ها پس از یک روز نگهداری در هر دو دمای مورد آزمایش تغییر محسوسی نکرده است در حالی که این خصوصیت پس از 30 روز نگهداری در دمای 4 درجه سلسیوس برابر با 60/5 درصد و در دمای درجه سلسیوس برابر 58/5 بوده است )جدول 6(. با توجه به نتایج بدست آمده می توان بیان داشت که پایداری امولسیون ها در دمای 4 درجه سلسیوس به مقدار اندکی بیشتر بوده است که این بسیاری از محققین می باشد نتیجه مشابه با گزارشات.(Raji et al., ) پولوالن همچون سایر هیدروکلوئیدها به دلیل داشتن نواحی آبدوست و آبگریز دارای فعالیت امولسیفایری می باشد Huang et al., ( 0(. از طرفی این اگزوپلی ساکارید با ایجاد یک الیه در اطراف قطرات فاز پراکنده و همچنین افزایش ویسکوزیته در اثر جذب آب سبب کاهش سرعت بهم پیوستن قطرات شده و در نتیجه ثبات امولسیونها را افزایش می دهد (Wendin &.Hall, 0) دما )درجه سلسیوس( مدت نگهداری )روز( پولوالن نتيجه گيری جدول 6. فعاليت امولسيفايری و پايداری امولسيونی محلول درصد وزنی/ حجمی پولوالن فعالیت امولسیفایری )%( پایداری امولسیون )%( 30 58/5 63 30 60/5 4 63 63 با توجه به کاربرد گسترده پولوالن در صنایع مختلف به منظور کاهش هزینه های تولید آن میتوان از ضایعات مختلف کشاورزی به عنوان سوبسترای جامد استفاده نمود. نتایج این تحقیق نشان داد که ضایعات انار سوبسترای جامد مناسبی جهت تولید این بیوپلیمر توسط سویه بومی Aureobasidium Pullulans میباشد. با توجه به نتایج آنالیز آماری به روش n K 0/96 0/054 0/92 0/085 0/ 0/6 0/35

326 مهندسی بيوسيستم ايران دوره 48 شماره 3 پاييز 396 سطح پاسخ بیشترین میزان تولید پولوالن در شرایط بهینه %5 و نسبت رطوبت به v/v 52/50 حاصل شد که در مقایسه با /5 درصد تلقیح: g/kg :ph( سوبسترا: 2/5( سوبستراهای مختلف مورد بررسی توسط سایر محققین مقدار قابل توجهی بوده است. پولوالن بدست آمده تحت شرایط بهینه دارای فعالیت امولسیفایری 63 درصد و پایداری پس 4 و امولسیون محلول آن به ترتیب در دمای C از 30 روز نگهداری 60/5 و 58/5 درصد بوده است. همچنین محلول پولوالن در غلظتهای پایین دارای رفتار نیوتنی بوده اما با افزایش غلظت از نیوتنی به رقیق شونده با برش تغییر رفتار میدهد. شکل 3. بررسی رفتار جريان محلول های پولوالن در غلظت های مختلف )0/ /0 0/5 و درصد حجمی/ وزنی( REFERENCES Bauer, R. (938) Physiology of DelllatiulIl pullulans de Bary. Zentralbl Bacteriol Parasitenkd Infektionskr Hyg Abt 298, 33-6 Bender, H., Lehmann, J., & Wallenfels, K. (959). Pullulan, ein extracelluläres Glucan von Pullularia pullulans. Biochimica et biophysica acta, 36(2), 309-36. Bernier, B. (958). The production of polysaccharides by fungi active in the decomposition of wood and forest litter. Canadian Journal of Microbiology, 4(3), 95-4. Chen, J., Wu, S. & Pan, S. (2). Optimization of medium for pullulan production using a novel strain of Auerobasidium pullulans isolated from sea mud through response surface methodology. Carbohydrate Polymers, 8(), 4. Choudhury, A.R., Bhattacharyya, M.S. & Prasad, G.S. (2). Application of response surface methodology to understand the interaction of media components during pullulan production by Aureobasidium pullulans RBF-4A3. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, (3), 232 23. Choudhury, A.R., Saluja, P. & Prasad, G.S. (). Pullulan production by an osmotolerant Aureobasidium pullulans RBF-4A3 isolated from flowers of Caesulia axillaris. Carbohydrate polymers, 83(4), pp.4 52. FDA, U.S. (02). Agency Response Letter: GRAS Notice No. GRN 000099 [Pullulan]. College Park, Maryland: US Food and Drug Administration (US FDA). Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN), Office of Food Additive Safety. Fischer, U.A., Carle, R. & Kammerer, D.R. (). Identification and quantification of phenolic compounds from pomegranate (Punica granatum L.) peel, mesocarp, aril and differently produced juices by HPLC-DAD ESI/MS n. Food chemistry, 2(2), 80 82. Göksungur, Y., Uçan, A. & Güvenç, U. (04). Production of pullulan from beet molasses and synthetic medium by Aureobasidium pullulans. Turkish Journal of Biology, 28(), 23 30. Göksungur, Y., Uzunoğulları, P. & Dağbağlı, S. (). Optimization of pullulan production from hydrolysed potato starch waste by response surface methodology. Carbohydrate polymers, 83(3), 330 33. Hosseini, S.S., Khodaiyan, F. & Yarmand, M.S. (6). Optimization of microwave assisted extraction of pectin from sour orange peel and its physicochemical properties. Carbohydrate Polymers, 40, 59 65. Huang, X., Kakuda, Y. & Cui, W. (0). Hydrocolloids in emulsions: particle size distribution and interfacial activity. Food Hydrocolloids, (4), 533 542. Islam, M. S., Rabbani, M. M., Yang, S. B., Choi, W. S., Choi, J. H., Oh, W.,... & Yeum, J. H. (4). Poly (vinyl alcohol)/pullulan Blend Nanofibres Prepared from Aqueous Solutions Using Electrospinning Method. Polymers & Polymer Composites, 22(9), 9. Kaneo, Y., Tanaka, T., Nakano, T., & Yamaguchi, Y. (0). Evidence for receptor-mediated hepatic uptake of pullulan in rats. Journal of Controlled Release, 0(3), 365-33. Lazaridou, A., Roukas, T., Biliaderis, C. G., & Vaikousi, H. (02). Characterization of pullulan produced from beet molasses by Aureobasidium pullulans in a stirred tank reactor under varying agitation. Enzyme and Microbial Technology, 3(), 22-32. Leathers, T.D. (03). Biotechnological production and applications of pullulan. Applied Microbiology and Biotechnology, 62(5-6), 468 43. Madi, N. S., Harvey, L. M., Mehlert, A., & McNeil, B. (99). Synthesis of two distinct exopolysaccharide fractions by cultures of the polymorphic fungus Aureobasidium pullulans. Carbohydrate Polymers, 32(3-4), 30-34. McClements, D.J. (). Food emulsions: principles,

32 ميرزايی و همکاران: بهينه سازی توليد بيوپليمر پولوالن توسط Aureobasidium pullulans از... practices, and techniques, CRC press. Mehta, A., Prasad, G.S. & Choudhury, A.R. (4). Cost effective production of pullulan from agriindustrial residues using response surface methodology. International journal of biological macromolecules, 64, 2 6. Moorthy, I. G., Maran, J. P., Muneeswari, S., Naganyashree, S., & Shivamathi, C. S. (). Response surface optimization of ultrasound assisted extraction of pectin from pomegranate peel. International journal of biological macromolecules, 2, 323-328. Oguzhan, P. & Yangilar, F.( 3). Pullulan: production and usage in food industry. Afr J Food Sci Technol, 4, 5 63. Piermaria, J.A., Mariano, L. & Abraham, A.G. (08). Gelling properties of kefiran, a food-grade polysaccharide obtained from kefir grain. Food Hydrocolloids, 22(8), 2. Prajapati, V.D., Jani, G.K. & Khanda, S.M. (3). Pullulan: an exopolysaccharide and its various applications. Carbohydrate polymers, 95(), 540 549. Raji, Z., Khodaiyan, F., Rezaei, K., Kiani, H., & Hosseini, S. S. (). Extraction optimization and physicochemical properties of pectin from melon peel. International Journal of Biological Macromolecules, 98, 09-6. Rekha, M.R. & Sharma, C.P. (0). Pullulan as a promising biomaterial for biomedical applications: a perspective. Trends Biomater Artif Organs, (2), 6 2. Roukas, T. (999). Pullulan production from deproteinized whey by Aureobasidium pullulans. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 22(6), 6 62. Salehi, M., Hosseini, S. A. E., Rasoulpour, R., Salehi, E., & Bertaccini, A. (6). Identification of a phytoplasma associated with pomegranate little leaf disease in Iran. Crop Protection, 8, 50-54. Sharma, N., Prasad, G.S. & Choudhury, A.R. (3). Utilization of corn steep liquor for biosynthesis of pullulan, an important exopolysaccharide. Carbohydrate polymers, 93(), 95 0. Shingel, K.I. (02). Determination of structural peculiarities of dexran, pullulan and γ-irradiated pullulan by Fourier-transform IR spectroscopy. Carbohydrate Research, 33(6), 445 45. Sugumaran, K. R., Gowthami, E., Swathi, B., Elakkiya, S., Srivastava, S. N., Ravikumar, R.,... & Ponnusami, V. (3). Production of pullulan by Aureobasidium pullulans from Asian palm kernel: A novel substrate. Carbohydrate polymers, 92(), 69-03. Sugumaran, K.R., Jothi, P. & Ponnusami, V. (4). Bioconversion of industrial solid waste Cassava bagasse for pullulan production in solid state fermentation. Carbohydrate polymers, 99, 22 30. Sugumaran, K.R. & Ponnusami, V. (). Conventional optimization of aqueous extraction of pullulan in solid-state fermentation of cassava bagasse and Asian palm kernel. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 0, 4 8. Sugumaran, K. R., Shobana, P., Balaji, P. M., Ponnusami, V., & Gowdhaman, D. (4). Statistical optimization of pullulan production from Asian palm kernel and evaluation of its properties. International Journal of Biological Macromolecules, 66, 229 235. Sutherland, I.W. (998). Novel and established applications of microbial polysaccharides. Trends in biotechnology, 6(), 4 46. Thirumavalavan, K., Manikkadan, T.R. & Dhanasekar, R., (09). Pullulan production from coconut byproducts by Aureobasidium pullulans. African journal of biotechnology, 8(2). Tsaliki, E., Pegiadou, S. & Doxastakis, G. (04). Evaluation of the emulsifying properties of cottonseed protein isolates. Food Hydrocolloids, 8(4), 63 63. Ullah, N. et al. (2). Proximate composition, minerals content, antibacterial and antifungal activity evaluation of pomegranate (Punica granatum L.) peels powder. Middle-East Journal of Scientific Research, (3), 396 40. Wang, D. et al. (4). Efficient production of pullulan using rice hull hydrolysate by adaptive laboratory evolution of Aureobasidium pullulans. Bioresource technology, 64, 2 9. Wendin, K. & Hall, G. (0). Influences of fat, thickener and emulsifier contents on salad dressing: static and dynamic sensory and rheological analyses. LWT-Food Science and Technology, 34(4), 222 233. Wu, S. et al. (6). Production of pullulan from raw potato starch hydrolysates by a new strain of Auerobasidium pullulans. International journal of biological macromolecules, 82, 40 43. Wu, S. et al. (09). Sweet potato: A novel substrate for pullulan production by Aureobasidium pullulans. Carbohydrate Polymers, 6(4), 645 649. Yadav, K. L., Rahi, D. K., & Soni, S. K. (4). Bioemulsifying potential of exopolysaccharide produced by an indigenous species of Aureobasidium pullulans RYLF0. PeerJ PrePrints, 2, e26v. Youssef, F., Biliaderis, C.G. & Roukas, T. (998). Enhancement of pullulan production by Aureobasidium pullulans in batch culture using olive oil and sucrose as carbon sources. Applied biochemistry and biotechnology, 4(), 3 30.